主要用途

細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對熒光峰值的變化，來測定細(xì)胞線粒體中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細(xì)胞（動物、人體等）內(nèi)線粒體鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中線粒體鈣離子在調(diào)節(jié)線粒體代謝、保持線粒體的ATP產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞需求，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。線粒體鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體純化。Rhod-2，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產(chǎn)物，一種與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光，同時其正電荷特性，特異性地聚集在線粒體里， 由此用于測定線粒體內(nèi)鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm，來定量測定線粒體的鈣濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）       40毫升

染色液（Reagent B）  30微升

介導(dǎo)液（Reagent C）      600微升

飽和液（Reagent D）        2毫升

陰性液（Reagent E）        2毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

• 測定準(zhǔn)備

• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、熒光酶標(biāo)儀檢測

• 準(zhǔn)備1個黑色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對照孔（不含細(xì)胞）、大對照孔（不含細(xì)胞）
• 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
• 加入100微升飽和液（Reagent D）到大對照孔里
• 加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對照孔里
• 分別加入10微升染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動酶標(biāo)板，混勻
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照
• 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
• 重復(fù)實驗步驟12和13一次 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計算樣品線粒體鈣離子濃度 

【（樣品RFU－空白對照孔RFU）÷（大對照孔RFU－樣品RFU）】X 570（納摩爾；解離常數(shù)）