動(dòng)物組織β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

動(dòng)物組織β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)方法，快速有效地裂解動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)高速離心，獲得澄清細(xì)胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應(yīng)體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發(fā)光底物，水解所產(chǎn)生的發(fā)光產(chǎn)物，通過(guò)發(fā)光探測(cè)儀（Luminometer）測(cè)定其相對(duì)冷光單位（RLU）的變化，以此進(jìn)行測(cè)算酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后的活體組織外源性以及衰老細(xì)胞內(nèi)源性半乳糖苷酶活性分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡(jiǎn)便、高度敏感。

技術(shù)背景

大腸桿菌的標(biāo)志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩(wěn)定，對(duì)蛋白水解降解作用抗性強(qiáng)，且容易測(cè)試。因此β-半乳糖苷酶成為目前常用的報(bào)告基因，以評(píng)價(jià)載體轉(zhuǎn)染的效果。在衰老細(xì)胞內(nèi)，顯示β-半乳糖苷酶活性。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發(fā)光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶（pH7.8）的催化下，去糖基化后，產(chǎn)生二惡二酮，進(jìn)而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動(dòng)反應(yīng)作用下，同時(shí)pH調(diào)整到12，由此二惡二酮分解，發(fā)出冷光，在冷光儀（475nm波長(zhǎng)）下，檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，來(lái)測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性。其發(fā)光產(chǎn)物半衰期為10分鐘，檢測(cè)敏感度可達(dá)20飛克（fg）。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     毫升

裂解液（Reagent B）   毫升

稀釋液（Reagent C）   微升

反應(yīng)液（Reagent D）   微升

堿性液（Reagent E）   毫升

啟動(dòng)液（Reagent F）   微升

陰性液（Reagent G）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和啟動(dòng)液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動(dòng)液（Reagent F）避免光照；堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)樣：用于建立β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

黑色96孔板：用于冷光檢測(cè)操作的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

冷光儀：用于樣品冷光檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，開啟化學(xué)發(fā)光儀預(yù)熱，設(shè)置波長(zhǎng)475nm；開啟恒溫水槽，設(shè)置溫度為37℃。同時(shí)從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動(dòng)液（Reagent F）避免光照。然后進(jìn)行下列操作：

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定200毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)一夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 從-70℃取出上述制備的待測(cè)樣品，置于冰槽里 
• 反應(yīng)液（Reagent D）和啟動(dòng)液（Reagent F）嚴(yán)格注意避光
• 設(shè)定好化學(xué)發(fā)光儀：溫度為30℃預(yù)熱和運(yùn)行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 
• 然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室的燈光

• 活性檢測(cè)

檢測(cè)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出xx微升稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室里。同時(shí)移出xx微升堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入xx微升啟動(dòng)液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為啟動(dòng)工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，并做好標(biāo)記：包括背景對(duì)照和待測(cè)樣品
• 分別加入50微升反應(yīng)工作液到所有測(cè)試孔里
• 加入xx微升陰性液（Reagent G）到背景對(duì)照孔里
• 加入5微升待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到待測(cè)樣品孔里
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入100微升啟動(dòng)工作液到所有測(cè)試孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻
• 室溫下靜置10秒，嚴(yán)格避免光照
• 即刻放進(jìn)冷光儀檢測(cè)：5秒整合檢測(cè)
• 獲得相對(duì)發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

• 樣品活性分析

1．計(jì)算公式

2．繪制RLU讀數(shù)（Y軸）和時(shí)間（X軸）關(guān)系曲線

五、樣品β-半乳糖苷酶實(shí)際活性單位計(jì)算（建議使用 β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線化學(xué)發(fā)光法測(cè)定試劑盒）

• 構(gòu)建β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫座標(biāo)（x軸）為每毫升β-半乳糖苷酶單位濃度；縱坐標(biāo)（y軸）為標(biāo)準(zhǔn)樣品讀數(shù)（吸光單位OD值）
• 根據(jù)β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)算樣品中含有β-半乳糖苷酶的活性單位（單位/毫克樣品）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織
• 本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到優(yōu)化
• 操作時(shí)，須戴手套
• 反應(yīng)液（Reagent D）和啟動(dòng)液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個(gè)操作須避光進(jìn)行，避免反復(fù)凍融
• 測(cè)讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 用戶可以測(cè)定組織裂解懸液的蛋白濃度，便于計(jì)算活性單位之需；建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量檢測(cè)試劑盒
• 加入啟動(dòng)工作液10秒后，即刻進(jìn)行冷光測(cè)定
• 如果用戶沒(méi)有冷光儀，可以使用閃爍探測(cè)器（scitillation counter 或β計(jì)數(shù)器）替代，但敏感性較低
• 如果是注射式冷光儀，建議測(cè)試前后使用無(wú)離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 相對(duì)發(fā)光讀數(shù)RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高
• 測(cè)定后，測(cè)定杯須清洗*
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低，則可以增加樣本量 
• 用戶可以使用β-半乳糖苷酶構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品酶活性單位檢測(cè)或使用β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線化學(xué)發(fā)光法測(cè)定試劑盒
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感