50742.1 v.A
細胞酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）活性光度法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
細胞酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過酪氨酸羥化酶反應系統(tǒng)
中底物酪氨酸羥基化后，受到高碘酸氧化后，產(chǎn)生多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定
細胞裂解懸液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于
各種人體和動物細胞裂解懸液樣品中酪氨酸羥化酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即
用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術背景
酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase；TH；EC1.14.16.2），又稱為酪氨酸3-單加氧酶（tyrosine 3-monooxygenase）
或L-酪氨酸四氫生物蝶呤：氧氣氧化還原酶-3-羥基化（L-tyrosine tetrahydropterin：oxygen
oxidoreductase-3-hydroxylating），屬于四聚體芳香族氨基酸羥化酶（tetrameric aromatic amino acid
hydroxylase）家族成員，為同源四聚體，由羧基末端四聚體化結構域、中央催化結構域和氨基末端調(diào)節(jié)結
構域組成，分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍交感神經(jīng)元（synphathatic neurons）、腎上腺髓質(zhì)（adrenal medulla）
等組織，催化L-酪氨酸（L-tyrosine）的羥基化反應，轉化為L-3,4-二羥基苯基丙氨酸（L-3,4-dihydroxyphenyl
alanine），即多巴（L-dopa），并由分子氧、二價鐵和四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin；BH4）作為輔因子
的參與，是神經(jīng)傳導介質(zhì)多巴胺（dopamine）、去甲腎上腺素（norepinephrine 或noradrenaline）和腎上腺素
（epinephrine,或adrenaline）等生物合成的*步。酪氨酸羥化酶受到各種激酶，例如MAPKAPK2、ERK1、
ERK2 等磷酸化而活性短暫增強，激素、藥物、cAMP、PKA、PKC 等促使酶活長期增強。酪氨酸羥化酶成
為慢性應激的標志。酪氨酸羥化酶異常，與阿茨漢姆癥、巴金森氏癥、Segawa 肌張力不全癥（Segawa’s
dystonia）、亨丁頓舞蹈癥（Huntington's disease）等有關?；诘孜锢野彼岷洼o因子二甲基四氫生物蝶呤
（6,7-dimethyl-5,6,7,8- tetrahydrobiopterin；DMTHP），在酪氨酸羥化酶的催化下，產(chǎn)生多巴，經(jīng)高碘酸鹽
的氧化，生成多巴色素，通過其吸光值的變化（475nm 波長），來定量測定酪氨酸羥化酶的活性。其反應系
統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 毫升
氧化液（Reagent E） 毫升
陰性液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、底物液（Reagent D）和氧化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃
冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
微型臺式離心機：用于樣品制備
比色皿或96 孔板：用于光度測定的容器
分光光度儀或酶標儀：用于光度分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后進
行下列操作。
一、樣品準備
1． 準備好25cm2 細胞培養(yǎng)瓶或60mm 細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至5 X 106 細胞）
2． 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10．轉移到預冷的1.5 毫升離心管
11．強力渦旋震蕩15 秒
12．置于冰槽里孵育30 分鐘
13．放進4℃微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管
15．移取10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備
1. 準備好上述待測樣品，置于冰槽里
2. 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長475nm
3. 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、背景對照測定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3． 加入xx 微升陰性液（Reagent F）
4． 加入xx 微升氧化液（Reagent E）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)
四、樣品測定
1. 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3. 加入50 微升待測樣品（注意：50 微克蛋白總量）
4. 加入xx 微升氧化液（Reagent E）
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
7. 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、計算樣品活性
六、酶標儀測定
1． 在96 孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
3． 分別加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 分別加入xx 微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（50 微克蛋白總量）
5． 分別加入xx 微升氧化液（Reagent D）
6． 輕輕搖動96 孔板
7． 在37℃培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
8． 即刻放進酶標儀檢測，獲得背景和樣品讀數(shù)
9． 活性計算
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20 次（比色皿）和80 次（96 孔板）操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1 次
4． 測定值由低到高變化；測定持續(xù)30 分鐘
5． 光度測定后，比色皿須清洗*
6． 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
7． 建議待測樣本蛋白濃度為50 微克/50 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本
公司提供Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
8． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
9． 可以使用酪氨酸羥化酶抑制劑曲酸（3-iodo-tyrosine；3IT）作為抑制劑對照或陰性對照
10．酪氨酸羥化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.0 條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1 納摩爾多巴所需的酶量
作為一個活性單位
11．本公司提供系列酪氨酸酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感